基本的にインスタンスごとにライセンスが必要です。
Hyper-Vの環境にWindows Serverを仮想マシンにインストールするのであれば、Volume Licenseでドメイン管理すれば、Microsoftによるサポートツールで適切にライセンスが管理できます。Windows 10をゲストにする場合もサポートの内容が多少異なりますが、Volume Licenseであれば、ライセンスが失われたりすることはありません。
参考:仮想マシンの自動ライセンス認証
https://docs.microsoft.com/ja-jp/windows-server/get-started-19/vm-activation-19
他の仮想環境の場合には、新しいライセンスを消費して新しい仮想マシンをセットアップする時には問題ないのですが、別の仮想マシンとして作り直したり、再インストールしようとすると、ボリュームのシリアル番号が最初にインストールした環境と違っていたりすると、ライセンス認証できないことがあります。この場合、それまで使っていたライセンスが失われ新規に新しいライセンスを要求される場合があります。
なお、ライセンス認証済みの仮想マシンイメージをコピーして、複数同時に起動することは、Volume Licenseであれば、所持しているライセンス数までであれば複数のインスタンスを同時に起動しても固有IDの関係で正常に動作できるかどうかを別にすればライセンス的には問題ありませんが、一般のライセンスの場合にはライセンス違反になります。
他の注意点として、10ms未満の間隔のタイマ割り込みを要求するようなマルチメディア系のアプリケーションや、ゲーム、リアルタイム制御関係などは、仮想環境におけるタイマ割り込みの精度の制限で正常に動作しないことがありますので注意してください。この制限については、仮想環境として、Hyper-Vでも、VMWareでも、何を使おうが共通の制限になります。